天然食品防腐剂一直是近年来研究和开发的重点。国内外的研究发现，许多植物精油，大蒜、洋葱、生姜、花椒、辣椒、苦瓜、荸荠、芦荟等食材中都存在着抗菌成分。近年来，人们开始从香辛料中提取有效成分作为食品防腐剂，获得了良好的效果。研究发现，香辛料中真正起防腐抗菌作用的是香精油，而目前研究与开发食品防腐剂一般使用的也是香辛料的精油或提取物。Knobloch等人对芳香植物精油的抗菌性能进行了考察和研究,Gocho对二十六种植物性芳香族化合物的抗菌效果进行了研究比较, 实验发现这些芳香化合物仅对湿孢子有抗菌效果而对干孢子却无效。我国吴传茂等人采用滤纸片法对20多种香料或中药材的抑菌效力进行了比较, 并就其中抑菌效力较好的迷迭香、辣椒、丁香、乌梅及甘草提取液适当复配, 分别应用于酱油及汽水的防腐, 结果三至六个月后细菌指标均达到合格标准。乔昕等人 对乌梅、丁香、甘草和花椒四种香料或中药材酒精提取物的抑菌作用及它们与糖的协同抑菌作用进行了实验研究, 并经正交试验将丁香、乌梅及甘草组成的复合天然防腐剂添加到薏苡奶中, 室温下储存半年, 未出现腐败变质现象。但是，专门针对大蒜、花椒、生姜、辣椒对大肠杆菌的抑菌作用的对比试验和成分复配抑菌试验以及用这四种食材成分研究开发天然食品防腐剂的报道十分少见。
从天然食材中提取抗菌成分，将这些成分应用到食品、医学、化妆品等方面，制作成对人体安全无害的天然抑菌防腐剂替代目前广泛使用的化学防腐剂，是食品、药品以及化妆品添加剂行业发展的必然趋势，同时也会促进生物化工领域相关行业的发展。

（1）本作品采用不同方法对四种天然食材的有效成分进行提取，采用平板菌落计数法对比测定它们对大肠杆菌的抑菌作用，并试验研究了浓度及不同成分复配混合对抑菌效果的影响，通过多组平行试验和空白对照，保证了结果的可靠性；同时，这种对比和成分复配抑菌试验目前国内还未见报道。
（2）我们的研究成果，能给用于食品、药品、化妆品等中的新型、安全、高效、天然食物源防腐剂的研究和开发提供参考。
（3）本作品不仅合理利用了天然食品资源，还能有助于提高了人们日常用品的安全性。

四种天然食材有效成分对大肠杆菌抑菌作用研究
胡凌琳 符千慧 孙睿 曾月姬 刘毅（指导教师、通讯作者）
（湖南机电职业技术学院工业分析与检验专业1301班，湖南长沙，410151）
摘要：通过用生、熟对比的方法从大蒜、生姜、辣椒、花椒这四种天然食材中制备提取液，采用平板菌落计数法测定它们对大肠杆菌的抑抑菌效果，测定了浓度及不同成分复配混合对抑菌效果的影响。试验结果表明，这四种食材中均含有抑制大肠杆菌的有效成分，其抑菌效果为：大蒜＞生姜＞辣椒＞花椒；在浓度较高时（体积比10%以上）对大肠杆菌抑菌效果较为明显，并且它们对大肠杆菌的抑菌活性均具有较好的热稳定性；各成分对大肠杆菌的抑菌作用有明显的协同作用，复配成分对大肠杆菌的抑菌效果是：大蒜：花椒1:1＞大蒜：生姜2:1＞四种成分1:1:1:1＞大蒜：生姜1:2＞花椒：辣椒1:1＞大蒜：辣椒1:1＞大蒜：生姜1:1（均为体积比）。
关键词：天然食材；有效成分；大肠杆菌；抑菌作用

大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%，是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不会致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示茵，因此大肠杆菌的的安全抑制显得十分重要。研究[1-2]表明，生姜、大蒜、辣椒和花椒等调味品，有明显的消毒、杀菌等作用。但是，对这四类调味品对大肠杆菌抑菌作用的对比研究，还少有报道。我们对此进行了试验研究，旨在为用于食品、药品、化妆品等中的新型、安全、高效、天然食物源防腐剂的研究和开发提供参考。
1 材料与方法
1.1材料与设备
1.1.1原材料
生姜、大蒜、辣椒、花椒（老姜、大蒜瓣、红辣椒、干花椒）均购于超市新鲜无腐烂。
1.1.2菌种
大肠杆菌。湖南机电职业技术学院微生物实验室提供。
1.1.3培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
1.1.4仪器与试剂
1、仪器：YXQ-LS-30SIIL立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；GZX-9070数显鼓风干燥灭菌器，（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SPX-150B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
电炉、100mL和10mL量筒、台秤、玻璃棒、无菌培养皿、1mL无菌吸管、脱脂棉、250mL和50mL烧杯、酒精灯、接种环、涂布棒、三角瓶等。
2、试剂：无水乙醇（AR），（天津市大茂化学试剂厂）；95%乙醇（AR），（天津市大茂化学试剂厂）；35%乙醇溶液（自配）；琼脂（食用级），（福建省石狮市宝航双塔琼脂加工厂）。
1.2、方法[3-4]
1.2.1生、熟液体的制备
1、将四种食材各取40g分别切碎平均分成两份，一份放入碾槽碾成汁。另一份加适量的蒸馏水（不超过100mL）在烧杯里蒸煮20min。
2、随后准备两个干净的烧杯，分别贴好生熟的标签。并在上边摊上4层纱布，用棉线固定，备用。
3、把粗加工好的生、熟溶液分别盛入对应烧杯。过滤时，生溶液可再加10mL蒸馏水冲洗碾槽内壁，再次过滤收集滤液。
4、过滤好后，分别添加蒸馏水使生、熟汁液都定容到100mL。
1.2.2平板制作
1.2.2.1生、熟料单成分平板制作
“生料”单成分平板：分别用量筒量取50mL四种生汁液，分别加入到四个装有灭菌并冷却到40℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基250mL的锥形瓶中，趁热摇匀，然后迅速倒成平板，各倒三个平板，每个培养皿15mL。
“熟料”单成分平板：分别用量筒量取50mL四种熟汁液，分别加入到四个装有灭菌并冷却到45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基250mL的锥形瓶中，趁热摇匀，然后迅速倒成平板，各倒三个平板，每个培养皿15mL。
1.2.2.2不同浓度成分料液平板制作
按上述平板制作方法，在每15mL牛肉膏蛋白胨培养基中分别加入0.6mL的不同浓度四种天然物质生的提取液（其提取液的浓度分别是原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液），制成平板备用。
1.2.2.3复合成分料液平板制作
分别将四种生的提取液进行以下复配：四种生的提取液分别等比混合、大蒜辣椒1:1混合、大蒜生姜1:1混合、大蒜生姜1:2混合、大蒜生姜2:1混合、大蒜花椒1:1混合、花椒辣椒1:1混合，每15mL牛肉膏蛋白胨培养基中加入0.6mL混合溶液，按上述方法各自制成平板备用。
1.2.2.4空白对照平板制作
把灭菌并冷却至45℃的未加添加任何抑制成分的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒成平板作为对照组，各倒三个平板，每个培养皿15mL。
1.2.3抑菌试验
1.2.3.1大肠杆菌菌悬液的制备[5]
1、把制备好的无菌水（每支9mL）取出编号1～6。
2、从经37℃24h活化培养的大肠杆菌斜面中取几环菌种置于1号试管中 ，摇匀。接着用十倍系列稀释法从1号试管一直稀释到6号试管。全程无菌操作。
1.2.3.2单成分抑菌试验
通过无菌操作，从6号试管中取菌悬液用1mL无菌吸量管吸取，接种于制作好的平板上，每个平板0.2mL，用涂布棒在培养基上涂布均匀，放入37℃培养箱倒置培养24h，观察结果。
1.2.3.3浓度对单成分抑菌率的影响试验
通过无菌操作，用1mL无菌吸量管吸取稀释到106倍的大肠杆菌菌悬液0.2mL于每个不同浓度成分料液平板中，用涂布棒在培养基上涂布均匀，放入37℃培养箱倒置培养24h，观察结果。
1.2.3.4复合成分抑菌试验
通过无菌操作，用1mL无菌吸量管吸取稀释到106倍的大肠杆菌菌悬液0.2mL于每个不同复配成分料液平板中，用涂布棒在培养基上涂布均匀，放入37℃培养箱倒置培养24h，观察结果。
2 结果与讨论
2.1单成分抑菌效果
观察发现不同单成分培养基平板上生长的大肠杆菌菌落对比很鲜明，无干扰因素的一组培养基上的大肠杆菌多且大，在生大蒜汁、生生姜汁的培养基平板上无菌落生长，生辣椒汁和生花椒汁中菌落生长比较多。熟培养基上菌落小（大约是无干扰因素组菌落的十～二十分之一大小），且稀疏，但是有一组异常数据，菌落大小是相差很大，但菌落数却是熟培养基比无干扰因素培养基的要多。详细情况如下表一。
表一 单成分抑菌试验平板菌落计数结果
培养基平板
抑菌成分 1号 2号 3号
生姜汁培养基 0个菌落 4个菌落 11个菌落
熟姜汁培养基 11个菌落 25个菌落 23个菌落
生大蒜汁培养基 0个菌落 0个菌落 0个菌落
熟大蒜汁培养基 12个菌落 5个菌落 35个菌落
生辣椒汁培养基 23个菌落 43个菌落 67个菌落
熟辣椒汁培养基 28个菌落 65个菌落 87个菌落
生花椒汁培养基 45个菌落 67个菌落 88个菌落
熟花椒汁培养基 38个菌落 64个菌落 126个菌落
无干扰培养基 46个菌落 79个菌落 175个菌落

由表一可见，四种食材试验成分对大肠杆菌的抑菌效果为大蒜＞生姜＞辣椒＞花椒；而且每种成分的相对生熟也会影响它们的抑菌效果，由表二可见每种天然食材都是生的时候的抑菌效果比较好，生的抑菌率比熟的抑菌率高了0.89%～19.21%，其中生姜差异最大，花椒差异最小。
表二 抑菌材料生熟状态对大肠杆菌抑菌率的影响
抑菌率/% 大蒜 生姜 辣椒 花椒
生 100 96.31 52,62 22.35
熟 82.53 77.1 35.71 21.46

因此，各个组分的抑菌率为：大蒜（生）＞生姜（生）＞大蒜（熟）＞生姜（熟）＞辣椒（生）＞辣椒（熟）＞花椒（生）＞花椒（熟）。

2.2浓度对单成分抑菌率的影响
结果见表三。可见，各成分的浓度对其抑菌率有显著影响，当它们稀释到100倍时，抑菌效果就都在50%以下了，其中花椒的抑菌效果降低至17.70%；稀释至1000倍时四种天然食材的抑菌效果均降低到10%以下，其中花椒完全失去了抑菌效果。

抑菌率/% 1000倍 100倍 10倍 原液
大蒜 9.11 44.69 83.72 100
生姜 4.60 37.61 78.11 89.85
辣椒 3.56 20.00 42.46 51.37
花椒 0 17.70 21.01 32.76
表三 不同浓度单成分对大肠杆菌的抑菌率
2.3复配成分抑菌效果
从表四可见，复配混合液的对大肠杆菌的抑菌效果比单一成分溶液的抑菌效果要好，4种溶液等体积混合、大蒜花椒1:1（体积比）、大蒜生姜2:1（体积比）其抑菌率都达到了90%以上，其中大蒜：花椒1:1复配对大肠杆菌的抑菌效果最好，而且花椒和辣椒这两种原本抑菌率较低的成分，混合之后的抑菌率也达到了85.40%，表明这些成分之间存在着对大肠杆菌抑菌的协同作用。在一些特殊的情况下（如对食品风味的要求），可以考虑花椒和辣椒的混合抑菌作用。

表四 复配成分对大肠杆菌的抑制效果
复配成分（体积比） 四种 成分
1:1:1:1 大蒜：辣椒
1:1 大蒜：生姜
1:1 大蒜：花椒
1:1 花椒：辣椒
1:1 大蒜：生姜
2:1 大蒜：生姜
1:2
抑菌率% 90.27 84.96 83.19 97.35 85.40 90.71 88.90

3 结论
试验用四种食材均含有对大肠杆菌产生明显的抑菌作用的成分，其中生大蒜中的有效成分对大肠杆菌的抑菌效果最为突出，而且，其即使经过100℃高温之后对大肠杆菌的抑制效果也有82.53%；生姜提取液对大肠杆菌的抑菌率也较高。同时，试验用四种食材有效成分对大肠杆菌的抑菌作用存在着显著的协同作用，其中大蒜与花椒的复配成分对大肠杆菌的抑菌率高达97.35%。这四种天然食材来源广泛、价格低廉、地域性低；尽管浓度对它们的抑菌效果有明显影响，当浓度较低时将失去抑菌效果，但是可以通过将这些成分适当复配，提高抑菌率，有望在浓度较低时也有显著的抑菌效果。因而，这四种食材可以考虑作为从中提取天然抑菌剂、制备绿色食品保鲜剂和药品、化妆品防腐剂的重要材料。

作品荣获湖南机电职业技术学院大学生“挑战杯”课外学术科技作品竞赛一等奖