有文献报道使用凝血酶亲和色谱法分离提取水蛭抗凝血活性成分，但凝血酶亲和层析介质的最佳制备条件及稳定性尚无文献进行研究。本文研究了凝血酶亲和层析介质的制备方法。首次以凝血酶活性为指标确定了凝血酶亲和层析介质的最佳制备条件。制备的亲和介质活性、稳定性良好，可在一定时间内反复使用。本文为凝血酶亲和层析介质制备提供了参考。 可用于含凝血酶抑制剂的天然药物筛选、分离和纯化。

一种凝血酶亲和层析介质的制备方法 摘要：对凝血酶-琼脂糖亲和层析介质的制备方法进行了研究。首先使用凝血酶和溴化氰活化的琼脂糖制备凝血酶-琼脂糖亲和层析介质，然后用生色底物法考察亲和层析介质上凝血酶的活性，首次以凝血酶活性为指标对最佳偶联条件进行了优化。结果表明：最佳条件为：使用pH 8.3 Na2CO3-NaHCO3溶液（含0.5 mol/L NaCl）为缓冲溶液，凝血酶用量为每1 g层析介质加入凝血酶200 U，室温反应10 h。在最佳条件下所制备的层析介质有较好的稳定性，在4 ℃条件下存放40天，亲和介质上的凝血酶活性仍有70.6%保留。该亲和层析介质可广泛用于含凝血酶抑制剂的天然药物筛选和分离纯化。 关键词：凝血酶；亲和层析；生色底物法 亲和层析（affinity chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力进行分离的色谱技术。如酶与底物及抑制剂、抗体与抗原、激素与受体之间存在特异性亲和作用力，将其中之一作为配基制备固定相，用于色谱分离或者分子间相互作用研究(1)。常见的亲和层析类型有：生物亲和层析、免疫亲和层析、固定化金属离子亲和层析等。亲和层析技术由于特异性强、纯化步骤简单等被广泛应用于抗原、抗体、抑制剂等的分离纯化(2-8)。 以凝血酶为配基进行亲和层析，可以用于凝血酶直接抑制剂的筛选。文献曾报道将凝血酶偶联琼脂糖凝胶作为亲和层析介质用于水蛭抗凝活性成分筛选，经过凝血酶亲和层析介质纯化后的产品抗凝血酶活性可以达到7700 U/mg，然而偶联条件如：反应时间、反应pH、凝血酶的用量，偶联后的亲和层析介质稳定性等却未见报道 (9-12)。事实上，在进行偶联时，配基的用量、偶联的反应条件等将对亲和层析介质的性质产生重要影响，不恰当的偶联方法可能引起偶联量、偶联位点、偶联取向不合适或者产生空间位阻等现象(13,14)。因此有必要对偶联条件进行控制，目前多通过分光光度法、酶解法、元素分析法等方法测定配基的偶联量，从而确定偶联条件。但亲和层析介质的好坏应该通过其亲和能力来控制，仅通过控制偶联量来制备亲和层析介质，显然是不够令人满意的。本实验首先采用化学键合的方法将凝血酶偶联到溴化氰活化的琼脂糖上，然后以Chromozym TH为生色底物，考察偶联介质上凝血酶的活性。首次以凝血酶的活性为指标优化了反应的pH、凝血酶用量等反应条件，并对偶联层析介质的稳定性进行了考察。本实验结果为凝血酶抑制剂的筛选以及含有抗凝活性成分天然药物筛选提供了快速可靠的方法。 1实验部分 1.1仪器与试剂 TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。溴化氰活化琼脂糖凝胶CNBr-activated Sepharose 4B（北京拜耳迪生物技术有限公司），凝血酶Thrombin（Sigma，T6884，1 KU），生色底物Chromozym TH（Roche）。其它试剂均为分析纯，实验用水为娃哈哈纯净水。 1.2 溶液配制 凝血酶溶液的配制：取凝血酶1支（1 KU），加蒸馏水稀释成10、40、100 U/mL的溶液，分装保存于-20 ℃冰箱中。 生色底物溶液的配制：精密称量5.0 mg Chromozym TH，加入4 mL水溶解，分装保存于-20 ℃冰箱中。 缓冲溶液的配制：分别配制0.1 mol/L的 Na2CO3和NaHCO3溶液（均含0.5 mol/L NaCl），用Na2CO3溶液滴定NaHCO3溶液，调节其pH分别为7.8、8.3、9.0、10.0。 1.3 溴化氰活化琼脂糖凝胶的预处理 称取CNBr-activated Sepharose 4B，浸于1 mol/L盐酸中溶胀，并用1 mol/L HCl抽滤冲洗，按照每1 g凝胶加入200 mL盐酸的量分批次冲洗凝胶。 1.4生色底物法测定凝血酶活性 分别取0.5、1、1.5、2、3 μL10 U/mL的凝血酶溶液，加入不同体积的缓冲溶液，使体积为340 μL，混匀，37 ℃温育2 min后，加入10 μL Chromozym TH溶液，摇匀，37 ℃温育5 min，加入50 μL 50%（v/v）醋酸溶液终止反应，在405 nm下测定吸光度。 1.5 偶联时间的选择 将经预处理的CNBr-activated Sepharose 4B加入到pH 8.3的缓冲溶液中，再加入凝血酶溶液，混匀。反应过程中温和摇动反应液，每隔2 h，400 r/min离心5 min后，取上清液在280 nm处测定吸光度，直到吸光度不再降低。 1.6偶联pH的选择 称取CNBr Sepharose 4B 400 mg，经盐酸预处理后均分为4等份，分别加入500 μLpH 7.8、8.3、9.0、10.0的缓冲溶液，然后按照每1 g干凝胶加入100 U配基的量加入凝血酶溶液，室温下振荡反应10 h。反应液400 r/min离心5 min后，弃去上清液，下层凝胶用大量的pH 8.3的缓冲溶液反复清洗数次。将不同pH条件下偶联得到的凝胶转移至5 mL容量瓶中，用pH 8.3的缓冲溶液定容，摇匀后，取出20 μL，加入320 μL pH 8.3的缓冲溶液，按照1.4项下操作进行生色底物反应，反应液离心后上清液在405 nm下测定吸光度。 1.7偶联酶量的选择 称取CNBr-Sepharose 4B 500 mg，经盐酸预处理后，均分为5份，加入pH 8.3的缓冲液，按照每1 g干凝胶加入100、200、400、600、1000 U配基的量加入凝血酶溶液。室温下振荡反应10 h。反应液按1.6项下操作进行清洗、定容，并进行生色底物反应测定吸光度。 1.8 偶联凝血酶稳定性考察 按照加酶量为200 U/g，在pH 8.3的缓冲溶液中，按照1.6项下操作制备凝血酶偶联琼脂糖层析介质，最后用pH 8.3的缓冲溶液定容于5 mL的容量瓶，4 0C保存。按生色底物法操作，每隔5天取出一部分测定凝血酶的活性，考察凝血酶偶联琼脂糖层析介质的稳定性。 2结果与讨论 2.1生色底物法测定凝血酶活性线性考察 凝血酶与其底物Chromozym TH反应生成的产物对硝基苯胺，在405 nm处有吸收。在底物浓度过量情况下，405 nm处的吸光度应与凝血酶的用量成正比。实验中考察了凝血酶（10 U/mL）加入量在0.5-5 μL范围内变化时吸光度变化情况，结果表明当凝血酶的加入量在0.5-3 μL范围内，即5*10-3-30*10-3U范围内时，吸光度随凝血酶加入量线性增加，线性回归方程为Y=0.0148X-0.018 。继续增大凝血酶的加入量至4或5 μL时，吸光度值不再线性增加。 2.2偶联时间的选择 凝血酶与琼脂糖介质偶联后，反应液经离心，上清液中游离的凝血酶减少，A280降低，完全反应后，A280不再改变，从而确定反应时间。实验中发现，凝血酶与CNBr -Sepharose 4B偶联反应速度较快，0-4 h内吸光度迅速降低，反应6 h后吸光度值不再明显下降，为保证完全反应，反应时间适当延长至10 h。 2.3偶联pH条件的选择 偶联反应pH值，一方面影响凝血酶的活性，另一方面会影响偶联量及偶联位点等。实验中考察了pH在7.8-10.0之间变化时对亲和层析介质的影响，并用生色底物法测定了不同pH条件下层析介质上凝血酶的活性。当pH为7.8、8.3和9.0时生色反应所测得的吸光度值无明显变化。可能是由于凝血酶的活性范围是pH 5.0-10.0( 8.3为最佳pH)，在该pH范围内，凝血酶活性基本不受影响。且反应结束后将亲和层析介质置于pH 8.3的缓冲液中，恢复了其最佳pH条件，因此测定的活性相差不大，而pH为10.0时，凝血酶在该条件下不稳定，即使反应后将pH恢复至最佳，凝血酶的活性也不可再恢复。 2.4偶联酶量的选择 配基用量是制备亲和层析介质时的重要参数。酶用量过低时会造成偶联配基活力不足和层析介质的浪费；酶用量过高时，可能造成偶联位点过多、偶联取向不合适或者形成空间位阻等，导致配基亲和能力降低或者配基的浪费。实验中考察了凝血酶用量在100-1000 U/g变化时，亲和层析介质对生色反应的影响。当凝血酶用量从100 U/g增加到200 U/g时，吸光度及偶联凝血酶的活性显著增加；而从200 U/g增加到1000 U/g时，吸光度及偶联凝血酶的活性也在逐渐增加，但增加趋势缓慢，而回收率却明显降低。可能是由于凝血酶用量较高时，由于反应位点不足、空间位阻等原因，造成偶联凝血酶的活性增加缓慢，使大部分凝血酶未与层析介质偶联，回收率降低。从实验结果看，凝血酶用量控制在200 U/g为合适的配基用量，这与文献报导的151 U/g基本吻合(12)。 2.5凝血酶亲和层析介质稳定性考察 在选定的最优条件下，利用生色底物法测定偶联凝血酶层析介质的稳定性，结果见图3所示。在测定的时间内，所测得的吸光度值逐渐降低，表明凝血酶的活性逐渐降低，但下降趋势比较缓慢，40天时偶联琼脂糖凝胶上的凝血酶活性仍有最初制备时的70.6%。有文献报导，凝血酶的水溶液在常温下24 h就会完全失活(15)，将凝血酶偶联到琼脂糖凝胶后，凝血酶的稳定性得到很大提高，因此所合成的凝血酶亲和层析介质可以在一定的时间内反复使用。 3结论 本文制备了凝血酶-琼脂糖亲和层析介质，用生色底物法考察了亲和层析介质上凝血酶的活性，并以凝血酶活性为指标筛选出了最佳的偶联条件。此外，该凝血酶亲和层析介质有较好的稳定性，可以在一定时期内反复使用。所制备的凝血酶亲和层析介质可用于凝血酶抑制剂的筛选、分离纯化。 参考文献： 1. Campbell D H, Luescher E, Lerman L S. Proc Natl Acad Sci U S A, 1951, 37(9): 575 2. Prasanna R R, Vijayalakshmi M A. Pure Appl Chem, 2010, 82(1): 39 3. Cheung R C F, Wong J H, Ng T B. Appl Microbiol Biot, 2012, 96(6): 1411 4. Leitner A. TrAC-Trend Anal Chem, 2010, 29(2): 177 5. Marchetti N, Caciolli L, Lagana A, et al. Anal Chem, 2012, 84(16): 7138 6. Yang H, Gurgel P V, Carbonell R G. J Chromatogr A, 2009, 1216(6): 910 7. Hage D S, Anguizola J A, Bi C, et al. J Pharmaceut Biomed, 2012, 69: 93 8. Chen Y H, Huang H M, Li R Q. Chinese Journal of Chromatography (陈义烘，黄慧敏，李任强.色谱)，2007, 25(3): 332 9. Mao S J T, Yates M T, Owen T J, et al. Biochemistry, 1988, 27: 8170 10. Electricwala A, Sawyer R T, Jones C P, et al. Blood Coagul Fibrin. 1991, 2(1): 83 11. Tong X R, Wang D B, Ma S B. Journal of Kuning Teachers College(仝向荣，王德斌，马绍宾.昆明师范高等专科学校学报), 2004, 26(4): 70 12. Strube K H, Kroger B, Bialojan S, et al. J Biol Chem, 1993, 268(12): 8590 13. Rogero C, Chaffey B T, Mateo-Marti E, et al. Phys Chem C, 2008, 112(25): 9308 14. Hage D S. Affinity Chromatography. Encyclopedia of Analytical Chemistry. 2006: 1-18 15. Deng Z Q, Qu X J, Ouyang Y. Medical Journal of Wuhan University(邓兆群，屈雪菊，欧阳怡. 湖北医科大学学报), 1996, 17（2）: 195

获得第七届“挑战杯”首都大学生课外学术科技作品竞赛二等奖