金银花为河南重要的地道药材,本作品以金银花为实验材料,对其根、茎、叶、花不同组织器官的内生菌进行分离、纯化;通过TLC、HPLC等方法对筛选出的内生菌次生代谢产物进行分析,筛选出3株产绿原酸的菌株,对其进行形态学鉴定,对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择,并对菌株发酵液进行抑菌学实验。为金银花活性成分-绿原酸的工业化生产提供理论依据。
选取健康金银花植株的不同组织部位(新鲜根、茎、叶、花)作为内生菌分离实验材料,用平板划线法,点植法进行分离。实验过程中设有对照:吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水,涂布于培养基上,经培养如无微生物长出,表明表面消毒彻底,分离到的是内生菌。经过反复分离、筛选、纯化出了107株内生菌,其后用菌落观察和镜检的方法去除重复,最终得到86株内生菌。对86株内生菌进行发酵后,用TLC法进行检测,结果显示次生代谢产物与绿原酸比移值相同的菌株有三株。为了确定这些次生代谢产物是否是含绿原酸,本次实验研究进一步用HPLC法对其进行检查,检测结果与TLC法结果一致。其后以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌,通过琼脂扩散法对菌株抑菌活性进行研究,实验结果得出,菌株对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌具有较强的抑菌活性,抑菌效果与金银花药材基本相同,而对大肠杆菌则表现出较弱的抑菌活性。利用形态比较法对菌落、菌丝体、孢子形态特征的认真观察分析,鉴定3株产绿原酸菌株,分别为毛霉属、曲霉属、青霉属。为了提高内生菌产生次生代谢产物的效率,对内生菌二次发酵的培养条件进行优化即:碳源、氮源以及培养温度进一步做了考察,最终确定最适培养条件为:发酵培养基为PDB培养基,培养条件为28℃,120r/min,震荡培养72小时。
第十二届“挑战杯”作品 三等奖
2011年河南省第九届“挑战杯”大学生课外学术科技作品省级竞赛特等奖;2011年河南中医学院第四届“挑战杯”大学生课外学术科技作品校级竞赛二等奖